आणविक जैविक अनुसंधान विधियां आधुनिक चिकित्सा, फोरेंसिक और जीव विज्ञान में एक बड़ी भूमिका निभाती हैं। डीएनए और आरएनए के अध्ययन में प्रगति के लिए धन्यवाद, एक व्यक्ति एक जीव के जीनोम का अध्ययन करने, रोग के प्रेरक एजेंट को निर्धारित करने, एसिड के मिश्रण में वांछित न्यूक्लिक एसिड को पहचानने आदि में सक्षम है।
आणविक जैविक अनुसंधान के तरीके। यह क्या है?
70 और 80 के दशक में वैज्ञानिकों ने पहली बार मानव जीनोम को समझने में सफलता हासिल की। इस घटना ने आनुवंशिक इंजीनियरिंग और आणविक जीव विज्ञान के विकास को गति दी। डीएनए और आरएनए के गुणों के अध्ययन ने इस तथ्य को जन्म दिया है कि अब इन न्यूक्लिक एसिड का उपयोग किसी बीमारी के निदान के लिए संभव है, जीन का अध्ययन करें।
डीएनए और आरएनए प्राप्त करना
आणविक जैविक निदान विधियों में प्रारंभिक सामग्री की उपस्थिति की आवश्यकता होती है: अधिक बार यह न्यूक्लिक एसिड होता है। इन पदार्थों को जीवित जीवों की कोशिकाओं से अलग करने के कई तरीके हैं। उनमें से प्रत्येक के अपने फायदे और नुकसान हैं, और यह आवश्यक हैशुद्ध न्यूक्लिक एसिड को अलग करने के लिए एक विधि चुनते समय ध्यान में रखें।
1. मर्मर के अनुसार डीएनए प्राप्त करना। विधि में अल्कोहल के साथ पदार्थों के मिश्रण का उपचार होता है, जिसके परिणामस्वरूप शुद्ध डीएनए अवक्षेपित होता है। इस पद्धति का नुकसान आक्रामक पदार्थों का उपयोग है: फिनोल और क्लोरोफॉर्म।
2. बूम के अनुसार डीएनए का अलगाव। यहां इस्तेमाल किया जाने वाला मुख्य पदार्थ गुआनिडीन थियोसाइनेट (GuSCN) है। यह विशेष सब्सट्रेट पर डीऑक्सीराइबोन्यूक्लिक एसिड की वर्षा में योगदान देता है, जिससे इसे बाद में एक विशेष बफर का उपयोग करके एकत्र किया जा सकता है। हालांकि, जीयूएससीएन पीटीसी का अवरोधक है, और इसका एक छोटा सा हिस्सा भी जो अवक्षेपित डीएनए में मिल जाता है, पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन के पाठ्यक्रम को प्रभावित कर सकता है, जो न्यूक्लिक एसिड के साथ काम करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है।
3. अशुद्धियों का अवसादन। यह विधि पिछले वाले से अलग है कि यह डीऑक्सीराइबोन्यूक्लिक एसिड के अणु नहीं हैं जो अवक्षेपित हैं, लेकिन अशुद्धियाँ हैं। ऐसा करने के लिए, आयन एक्सचेंजर्स का उपयोग किया जाता है। नुकसान यह है कि सभी पदार्थ अवक्षेपित नहीं हो सकते हैं।
4. मास स्क्रीनिंग। इस पद्धति का उपयोग उन मामलों में किया जाता है जहां डीएनए अणु की संरचना के बारे में सटीक जानकारी की आवश्यकता नहीं होती है, लेकिन कुछ सांख्यिकीय डेटा प्राप्त करना आवश्यक होता है। यह इस तथ्य से समझाया गया है कि डिटर्जेंट, विशेष रूप से क्षार के साथ इलाज करने पर न्यूक्लिक एसिड की संरचना क्षतिग्रस्त हो सकती है।
अनुसंधान विधियों का वर्गीकरण
सभी आणविक जैविक अनुसंधान विधियों को तीन बड़े समूहों में बांटा गया है:
1. प्रवर्धन (कई एंजाइमों का उपयोग करके)। यहांपीसीआर - पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन को संदर्भित करता है, जो कई नैदानिक विधियों में एक बड़ी भूमिका निभाता है।
2. गैर-प्रवर्धक। विधियों का यह समूह सीधे न्यूक्लिक एसिड के मिश्रण के संचालन से संबंधित है। उदाहरण 3 ब्लॉट हैं, स्वस्थानी संकरण में, आदि।
3. एक जांच अणु से एक संकेत की पहचान पर आधारित तरीके जो एक विशिष्ट जांच डीएनए या आरएनए को बांधते हैं। एक उदाहरण हाइब्रिड कैप्चर सिस्टम (hc2) है।
एंजाइम जिनका उपयोग आणविक जीव विज्ञान अनुसंधान विधियों में किया जा सकता है
कई आणविक निदान विधियों में एंजाइमों की एक विस्तृत श्रृंखला का उपयोग शामिल है। नीचे सबसे अधिक उपयोग किया जाता है:
1. प्रतिबंध एंजाइम - डीएनए अणु को आवश्यक भागों में "कट" करता है।
2. डीएनए पोलीमरेज़ - डीऑक्सीराइबोन्यूक्लिक एसिड के दोहरे-असहाय अणु को संश्लेषित करता है।
3. रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस (रिवर्टेज) - एक आरएनए टेम्पलेट पर डीएनए को संश्लेषित करने के लिए उपयोग किया जाता है।
4. डीएनए लिगेज - न्यूक्लियोटाइड्स के बीच फॉस्फोडाइस्टर बांड के निर्माण के लिए जिम्मेदार।
5. Exonuclease - डीऑक्सीराइबोन्यूक्लिक एसिड अणु के टर्मिनल वर्गों से न्यूक्लियोटाइड को हटा देता है।
पीसीआर डीएनए प्रवर्धन की मुख्य विधि है
पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) आधुनिक आणविक जीव विज्ञान में सक्रिय रूप से उपयोग किया जाता है। यह एक ऐसी विधि है जिसमें एक एकल डीएनए अणु (अणुओं को प्रवर्धित किया जाता है) से बड़ी संख्या में प्रतियां प्राप्त की जा सकती हैं।
पीसीआर के मुख्य कार्य:
- निदानरोग;
- डीएनए खंडों, जीनों की क्लोनिंग।
एक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन करने के लिए निम्नलिखित तत्वों की आवश्यकता होती है: प्रारंभिक डीएनए अणु, एक थर्मोस्टेबल डीएनए पोलीमरेज़ (टाक या पीएफयू), डीऑक्सीराइबोन्यूक्लियोटाइड फॉस्फेट (नाइट्रोजनस बेस के स्रोत), प्राइमर (प्रति 1 डीएनए अणु में 2 प्राइमर)) और बफर सिस्टम ही, जिसमें सभी प्रतिक्रियाएं संभव हैं।
पीसीआर में तीन चरण होते हैं: विकृतीकरण, प्राइमर एनीलिंग और बढ़ाव।
1. विकृतीकरण। 94-95 डिग्री सेल्सियस के तापमान पर, डीएनए के दो स्ट्रैंड के बीच हाइड्रोजन बांड टूट जाता है, और इसके परिणामस्वरूप हमें दो एकल-फंसे अणु मिलते हैं।
2. प्राइमर एनीलिंग। 50-60 डिग्री सेल्सियस के तापमान पर, प्राइमरों को पूरकता के प्रकार द्वारा एकल-फंसे हुए न्यूक्लिक एसिड अणुओं के सिरों से जोड़ा जाता है।
3. बढ़ाव। 72 डिग्री के तापमान पर, डीऑक्सीराइबोन्यूक्लिक एसिड के दोहरे-असहाय अणुओं का संश्लेषण होता है।
डीएनए अनुक्रमण
आणविक जैविक अनुसंधान विधियों में अक्सर एक डीऑक्सीराइबोन्यूक्लिक एसिड अणु में न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम के ज्ञान की आवश्यकता होती है। आनुवंशिक कोड निर्धारित करने के लिए अनुक्रमण किया जाता है। भविष्य का आणविक निदान मानव अनुक्रमण से प्राप्त ज्ञान पर आधारित होगा।
निम्न प्रकार के अनुक्रमण प्रतिष्ठित हैं:
- मैक्सम-गिल्बर्ट अनुक्रमण;
- सेंगर अनुक्रमण;
- पाइरोग्रेडिंग;
- नैनोपोरअनुक्रमण।
