बैक्टीरिया की खेती: तरीके, सिद्धांत, कदम और शर्तें

2024 लेखक: Angel Austin | [email protected]. अंतिम बार संशोधित: 2023-12-17 05:27

हमारे चारों ओर प्रकृति में सूक्ष्मजीव हर जगह हैं: मिट्टी में, जल निकायों में, विभिन्न वस्तुओं की सतहों पर, लोगों और जानवरों का निवास होता है। यह सब भोजन, दवाओं और उत्पादन लाइनों के माइक्रोबियल संदूषण के स्रोत के रूप में काम कर सकता है। बैक्टीरिया की खेती उनके गुणों, जरूरतों और विशेषताओं का अध्ययन करने के लिए आवश्यक है। यह, बदले में, विभिन्न दवाओं के विकास, रोगों के प्रयोगशाला निदान, उत्पादन रिएक्टरों की गणना और बहुत कुछ में एक महत्वपूर्ण कदम है।

सामान्य अवधारणाएं

सूक्ष्मजीव विज्ञान में जीवाणुओं की खेती का तात्पर्य प्रयोगशाला में किए गए सूक्ष्मजीवों की खेती से है। बदले में, एक चयनित पोषक माध्यम पर उगने वाले रोगाणुओं को एक संस्कृति कहा जाता है। संस्कृतियों को मिश्रित किया जा सकता है यदि वे विभिन्न प्रकार के सूक्ष्मजीवों द्वारा बनते हैं, और शुद्ध यदि वे केवल एक प्रकार के बैक्टीरिया द्वारा दर्शाए जाते हैं।

यदि पोषणमाध्यम में केवल एक कोशिका रखी जाती है और इसके प्रजनन के परिणामस्वरूप व्यक्तियों का एक समूह प्राप्त होता है, तो सूक्ष्मजीवों के इस समूह को क्लोन कहा जाता है। जब एक क्लोन उस बिंदु तक विकसित हो जाता है जहां वह नग्न आंखों को दिखाई देता है, बैक्टीरिया के इस संग्रह को एक कॉलोनी कहा जाता है।

आमतौर पर अलग-अलग स्रोतों से अलग-अलग बैक्टीरिया की खेती एक-दूसरे से अलग-अलग की जाती है। रोगाणुओं के ऐसे प्रत्येक अलग-अलग विकसित समूह को स्ट्रेन कहा जाता है। इसलिए, यदि एक प्रकार के स्टेफिलोकोकस को तीन स्रोतों (या एक ही उत्पाद के अलग-अलग हिस्से, अलग-अलग लोग) से अलग किया जाता है, तो वे इस प्रकार के स्टेफिलोकोकस के तीन उपभेदों के बारे में बात करते हैं।

जीवाणु वृद्धि कारक

इनमें विभिन्न अमीनो एसिड, लिपिड, प्यूरीन बेस और सूक्ष्मजीवों के विकास के लिए आवश्यक अन्य यौगिक शामिल हैं। कुछ रोगाणु स्वतंत्र रूप से उन पदार्थों का उत्पादन कर सकते हैं जिनकी उन्हें आवश्यकता होती है, जबकि अन्य को उन्हें तैयार रूप में प्राप्त करने की आवश्यकता होती है। कुछ वृद्धि कारकों में सूक्ष्मजीवों की आवश्यकता के अनुसार जीवाणुओं की पहचान और विभेदन किया जाता है। साथ ही, प्रयोगशाला और जैव-प्रौद्योगिकी कार्य के लिए पोषक माध्यम की सही तैयारी के लिए यह पैरामीटर महत्वपूर्ण है:

• अमीनो एसिड। बैक्टीरिया को एक विशेष अमीनो एसिड या एसिड के समूह की आवश्यकता हो सकती है। तो, क्लोस्ट्रीडिया को ल्यूसीन और टाइरोसिन की आवश्यकता होती है, स्ट्रेप्टोकोकी को ल्यूसीन और आर्जिनिन की आवश्यकता होती है। जिन सूक्ष्मजीवों को बढ़ने के लिए बाहर से अमीनो एसिड की आवश्यकता होती है, उन्हें ऑक्सोट्रॉफ़्स कहा जाता है।
• प्यूरिन और पाइरीमिडीन बेस, साथ ही उनके डेरिवेटिव (एडेनिन, ग्वानिन और अन्य)। वे कई के विकास में एक महत्वपूर्ण कारक हैंस्ट्रेप्टोकोकस प्रजाति।
• विटामिन। वे बैक्टीरिया द्वारा आवश्यक कोएंजाइम का हिस्सा हैं। तो, निकोटिनिक एसिड, साथ ही इसके एमाइड, जो एनएडी और एनएडीपी का हिस्सा हैं, डिप्थीरिया और शिगेला कोरिनेबैक्टीरिया द्वारा आवश्यक हैं। थायमिन, पाइरोफॉस्फेट के एक अभिन्न अंग के रूप में, स्टैफिलोकोकस ऑरियस, न्यूमोकोकस, ब्रुसेला द्वारा आवश्यक है। पैंटोथेनिक एसिड, जो सीओए कोएंजाइम का हिस्सा है, टेटनस बेसिली और कुछ प्रकार के स्ट्रेप्टोकोकस द्वारा आवश्यक है। साइटोक्रोम, और इसलिए फोलिक एसिड, हेम्स और बायोटिन जो उन्हें बनाते हैं, माइकोबैक्टीरियम ट्यूबरकुलोसिस और हीमोफिलस इन्फ्लुएंजा के लिए आवश्यक हैं।

पर्यावरण आवश्यकताएँ

जीवाणु संवर्धन के लिए कल्चर मीडिया के लिए शर्तें:

1. पोषण। उनमें ऐसे पदार्थ होने चाहिए, इसके अलावा, आसानी से पचने योग्य रूप में, सूक्ष्मजीवों के लिए आवश्यक ऊर्जा को खिलाने और फिर से भरने के लिए। इनमें ऑर्गेनोजेन्स और खनिज शामिल हैं। कुछ सूक्ष्मजीवों को अतिरिक्त रूप से विटामिन और अमीनो एसिड की आवश्यकता होती है जिन्हें वे संश्लेषित नहीं कर सकते।
2. इष्टतम पीएच स्तर। यह कोशिका झिल्ली की पारगम्यता को प्रभावित करता है और तदनुसार, जीवाणु द्वारा पोषक तत्वों को अवशोषित करने की क्षमता को प्रभावित करता है। अक्सर, पीएच मान 7, 2–7, 4 के स्तर पर होना चाहिए। कई सूक्ष्मजीव अपने जीवन के दौरान अम्लीय या क्षारीय प्रतिक्रियाओं वाले उत्पादों का उत्पादन करते हैं, और पोषक माध्यम के पीएच को नहीं बदलने के लिए, इसे बफ़र किया जाना चाहिए।
3. आइसोटोनिक। बैक्टीरिया की खेती के लिए पोषक माध्यम में आसमाटिक दबाव का मान समान होना चाहिएमाइक्रोबियल कोशिकाओं के अंदर। यह आमतौर पर 0.5% NaCl समाधान से मेल खाती है।
4. बाँझपन। यह इस तथ्य के कारण है कि विदेशी बैक्टीरिया की उपस्थिति विश्लेषण किए गए तनाव के अध्ययन के परिणामों को विकृत कर देगी।
5. आर्द्रता का स्तर। यह संकेतक, माध्यम की स्थिरता के साथ, एक विशेष प्रकार के बैक्टीरिया के लिए इष्टतम विशेषताएं होनी चाहिए।
6. रेडॉक्स क्षमता (RH2)। यह उन पदार्थों के अनुपात को दर्शाता है जो इलेक्ट्रॉनों को दान करते हैं और स्वीकार करते हैं, साथ ही पोषक माध्यम की ऑक्सीजन संतृप्ति का स्तर भी। एरोबेस और एनारोबेस के लिए, बैक्टीरिया की खेती की शर्तें इस सूचक में कुछ भिन्न होती हैं। अवायवीय सूक्ष्मजीव 5 से नीचे के RH2 मानों पर और एरोबिक सूक्ष्मजीवों में कम से कम 10 पर सबसे अच्छा प्रजनन करते हैं।
7. एकरूपता। यह महत्वपूर्ण है कि संस्कृति माध्यम में इसके व्यक्तिगत अवयवों की निरंतर मात्रा हो। इसके अलावा, स्पष्ट समाधानों को प्राथमिकता दी जाती है, जिससे फसल की वृद्धि पर नज़र रखना या संदूषण को नोटिस करना आसान हो जाता है।

संस्कृति मीडिया के प्रकार

बढ़ते सूक्ष्मजीवों के लिए एक विशेष माध्यम का चुनाव कई कारकों से प्रभावित होता है, जिनमें से उनके पोषण की विशेषताएं और अध्ययन का उद्देश्य हैं। पोषक माध्यमों के वर्गीकरण में अंतर्निहित मुख्य विशेषताएं हैं:

1. अवयव। सब्सट्रेट बनाने के लिए उपयोग किए जाने वाले प्रारंभिक पदार्थों के अनुसार, वे भेद करते हैं:

• प्राकृतिक, जो पशु या वनस्पति मूल के उत्पादों (जैसे मांस, दूध, फल) से तैयार किए जाते हैं और मिश्रित उगाने के लिए उपयुक्त होते हैंफसलें;
• अर्ध-सिंथेटिक, जिसमें महंगे प्राकृतिक खाद्य उत्पादों को गैर-खाद्य उत्पादों (उदाहरण के लिए, हड्डी का भोजन, रक्त के थक्के) द्वारा प्रतिस्थापित किया जाता है, और जो कुछ प्रकार के जीवाणुओं की खेती या उनके चयापचय उत्पादों को अलग करने के लिए इष्टतम होते हैं। पर्यावरण;
• सिंथेटिक, जो सटीक मात्रा में रासायनिक यौगिकों से तैयार किए जाते हैं, एक ज्ञात स्थिर संरचना होती है और आसानी से प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य होती है।

2. संगति (घनत्व)। विशिष्ट वातावरण:

• तरल;
• घना;
• अर्ध-तरल।

आखिरी दो को आवश्यक घनत्व बनाने के लिए अगर-अगर या जिलेटिन के अतिरिक्त विशेष समाधान या तरल पदार्थों से तैयार किया जाता है। इसके अलावा, क्लॉटेड ब्लड सीरम, आलू, सिलिका जेल मीडिया, कैरेजेनन बैक्टीरिया के विकास के लिए एक घना वातावरण है।

3. मिश्रण। इस आधार पर, वातावरण हैं:

• सरल, जिसकी सूची संक्षिप्त है वह है मीट पेप्टोन ब्रोथ (एमबीबी), हॉटिंगर ब्रोथ और अगर, मीट पेप्टोन एगर (एमपीए), पोषक जिलेटिन और पेप्टोन वाटर।
• जटिल, रक्त, मट्ठा, कार्बोहाइड्रेट और अन्य पदार्थों को मिलाकर साधारण लोगों से तैयार किया जाता है।

4. नियुक्ति। निम्नलिखित पोषक माध्यम प्रतिष्ठित हैं:

• मुख्य का उपयोग कई रोगजनक रोगाणुओं (आमतौर पर सरल संरचना) को विकसित करने के लिए किया जाता है;
• साधारण सब्सट्रेट पर नहीं उगने वाले बैक्टीरिया को अलग करने और विकसित करने के लिए विशेष का उपयोग किया जाता है;
• चयनात्मक (वे भी चयनात्मक होते हैं) एक विशिष्ट प्रकार के बैक्टीरिया को अलग करने के लिए उपयुक्त होते हैं और संबंधित रोगाणुओं (चयनात्मकता) के विकास को रोकते हैंमीडिया में कुछ पदार्थों को जोड़कर बनाया गया, जैसे कि एंटीबायोटिक्स या लवण, या पीएच को समायोजित करके);
• डिफरेंशियल डायग्नोस्टिक्स एंजाइमी गतिविधि का आकलन करके एक प्रकार के बैक्टीरिया को दूसरे से अलग करना संभव बनाता है, उदाहरण के लिए, माध्यम का;
• नमूने के बाद के परिवहन के साथ प्रारंभिक टीकाकरण के लिए परिरक्षकों की आवश्यकता होती है, क्योंकि वे सूक्ष्मजीवों की मृत्यु को रोकते हैं, साथ ही साथ अन्य जीवाणुओं के विकास को रोकते हैं।

मीडिया की तैयारी

अवायवीय जीवाणुओं की खेती में सबसे महत्वपूर्ण कदम एक उपयुक्त पोषक माध्यम की तैयारी है। इष्टतम पैरामीटर चुने जाने के बाद, निम्न चरणों पर आगे बढ़ें:

• तौलना, एक विश्लेषणात्मक संतुलन पर घटकों के एक नमूने का चयन करके;
• 70 डिग्री सेल्सियस तक गर्म किए गए आसुत जल में घोला जाता है, और फॉस्फेट, सूक्ष्म और मैक्रोसाल्ट अलग-अलग भंग कर दिए जाते हैं;
• पानी के स्नान में दो मिनट तक उबालना;
• इंडिकेटर पेपर या पोटेंशियोमीटर द्वारा पीएच निर्धारण;
• तरल के साथ-साथ पिघले हुए घने मीडिया के लिए गीले कपड़े या पेपर फिल्टर के माध्यम से निस्पंदन, और अगर मीडिया के लिए एक कपास-धुंध फिल्टर के माध्यम से;
• 3/4 क्षमता पर बॉटलिंग का प्रदर्शन;
• मध्यम निर्भर नसबंदी;
• बाँझपन का नियंत्रण थर्मोस्टैट में दो दिनों तक बसने के बाद किया जाता है, उसके बाद देखने के बाद;
• रासायनिक नियंत्रण पीएच और आवश्यक की सामग्री को स्थापित करने के लिएआइटम;
• परीक्षण टीका द्वारा जैविक नियंत्रण।

कांच के सामान और मीडिया की नसबंदी

जीवाणुओं की खेती के मूल सिद्धांतों में से एक बाँझपन है। विदेशी सूक्ष्मजीवों की वृद्धि और विकास इसकी रासायनिक संरचना और पीएच को बदलकर पोषक माध्यम की विशेषताओं को प्रभावित कर सकते हैं। शुद्ध संस्कृतियों को उगाने के लिए बंध्याकरण मुख्य शर्त है। व्यवहार में, इस शब्द का अर्थ है सतह पर और निष्फल वस्तुओं की मात्रा में बिल्कुल सभी जीवन रूपों को नष्ट करने के तरीके। अध्ययन के दौरान इस्तेमाल किए गए बर्तन, उपकरण, मीडिया और अन्य वस्तुओं को निष्फल कर दिया जाता है।

कुछ प्रकार की नसबंदी:

• इग्निशन। बुवाई, कांच की स्लाइड, कुछ यंत्रों को बर्नर या स्पिरिट लैंप का उपयोग करके किया जा सकता है।
• उबलते। सीरिंज, सुई, भोजन को संभालने के लिए उपयुक्त है, लेकिन जीवाणु बीजाणुओं को नहीं मारता है।
• सूखी गर्मी नसबंदी। यह एक विशेष सुखाने वाले कैबिनेट में किया जाता है और फ्लास्क, टेस्ट ट्यूब और अन्य प्रयोगशाला कांच के बने पदार्थ के प्रसंस्करण के लिए उपयुक्त है।
• भाप नसबंदी। एक आटोक्लेव में किया गया, यह विधि अत्यधिक प्रभावी है। लेकिन यह उच्च तापमान पर टूटने वाले प्रोटीन या किसी अन्य यौगिक वाले पोषक तत्व मीडिया के लिए उपयुक्त नहीं है। अधिक बख्शते को टाइन्डलाइज़ेशन कहा जा सकता है। यह कोच बॉयलर में किया जाता है और बीजाणुओं के अंकुरण को उनके विनाश के साथ जोड़ता है।
• पाश्चराइजेशन। इसका उपयोग मीडिया के लिए किया जाता है जो उबालने पर अपने गुणों को बदल देता है (उदाहरण के लिए, दूध, शराब, बीयर), जो करने में सक्षम हैउन्हें गैर-बीजाणु-असर वाले सूक्ष्मजीवों से छुटकारा दिलाएं। पंद्रह से तीस मिनट के लिए प्रसंस्करण तापमान केवल 50-60 डिग्री सेल्सियस है। कुछ मामलों में, ठंडे नसबंदी का उपयोग किया जाता है, फिल्टर या यूवी किरणों का उपयोग करके किया जाता है।

बैक्टीरिया की खेती की स्थिति

बैक्टीरिया की वृद्धि और विकास कुछ निश्चित कारकों और उनमें से प्रत्येक के मूल्यों के तहत ही संभव है:

1. तापमान। बैक्टीरिया के तीन समूह होते हैं जो तापमान वरीयताओं में भिन्न होते हैं:

• थर्मोफाइल, या गर्मी से प्यार करने वाले रोगाणु, 45-90 डिग्री सेल्सियस पर बढ़ते हैं, जिसका अर्थ है कि वे मानव और पशु जीवों में गुणा नहीं करते हैं;
• मनोरोगी, या ठंड से प्यार करने वाले सूक्ष्मजीव, 5-15 डिग्री सेल्सियस की सीमा में तापमान पसंद करते हैं और कोल्ड स्टोर में उगाए जाते हैं;
• मेसोफाइल, 25-37 डिग्री सेल्सियस के तापमान पर विकसित होते हैं, उनमें अधिकांश बैक्टीरिया शामिल होते हैं।

2. रोशनी। यह फोटोट्रॉफिक बैक्टीरिया की खेती की एक विशेषता है, क्योंकि वे प्रकाश संश्लेषक प्रक्रिया को अंजाम देते हैं। लेकिन अधिकांश रोगाणुओं के लिए, प्रकाश व्यवस्था एक पूर्वापेक्षा नहीं है। और इसके विपरीत भी, सौर पराबैंगनी उनके विकास को दबा सकती है।

3. पानी। सभी सूक्ष्मजीवों को सुलभ (तरल) रूप में पानी की आवश्यकता होती है। इसलिए जमे हुए भोजन में बैक्टीरिया की वृद्धि बहुत कम या बिल्कुल नहीं होती है।

4. पर्यावरण की अम्लता। बैक्टीरिया पैदा करने के इस सिद्धांत पर पहले ही ऊपर विस्तार से चर्चा की जा चुकी है।

5. वातन। ऑक्सीजन, एक रासायनिक तत्व के रूप में, पानी का एक अभिन्न अंग है और काफी संख्या में यौगिकों का उपयोग किया जाता हैसूक्ष्मजीवों की खेती। गैसीय ऑक्सीजन पानी और अन्य तरल पदार्थों में घुलित रूप में भी समाहित हो सकती है। बैक्टीरिया के एक महत्वपूर्ण हिस्से को ऑक्सीजन अणुओं की निरंतर आपूर्ति की आवश्यकता होती है। लेकिन कई सूक्ष्मजीवों के लिए, यह अनावश्यक है, या इससे भी बदतर, गैसीय ऑक्सीजन उनके लिए विषाक्त है, क्योंकि उनके पास केटेलेस और पेरोक्सीडेज नहीं है, जो जहरीले श्वसन उत्पादों को नष्ट करते हैं। इसलिए, अवायवीय जीवाणुओं की खेती में सबसे महत्वपूर्ण कदम पोषक माध्यम से O₂ अणुओं को हटाना है।

6. सूक्ष्मजीवों की खेती। एरोबिक और एनारोबिक बैक्टीरिया की खेती पर्यावरण की विभिन्न परतों में और विभिन्न तरीकों से की जाती है।

एरोबिक सूक्ष्मजीवों की खेती

एरोबिक बैक्टीरिया की खेती के लिए आणविक ऑक्सीजन की आवश्यकता होती है। चिकित्सा और खाद्य उद्योग में सफलतापूर्वक उपयोग किए जा सकने वाले एरोबिक्स की शुद्ध संस्कृतियों को प्राप्त करने के लिए, निम्नलिखित विधियों का उपयोग किया जाता है:

• सतह घने मीडिया पर या तरल मीडिया (उनकी पतली परत) में बढ़ती है जब ऑक्सीजन सीधे हवा से आती है;
• तरल मीडिया में गहरी खेती, जब उनमें घुली ऑक्सीजन की मात्रा में वृद्धि निरंतर वातन द्वारा प्राप्त की जाती है।

अवायवीय सूक्ष्मजीवों की खेती

इस प्रकार के जीवाणुओं की खेती का मूल सिद्धांत वायुमंडलीय ऑक्सीजन के साथ उनका न्यूनतम संपर्क है। एरोबिक्स की तुलना में उनके विकास के लिए स्थितियां प्रदान करना कहीं अधिक कठिन है। अवायवीय को आणविक O₂:

से अलग करने के लिए निम्नलिखित विधियों का उपयोग किया जाता है

1. शारीरिक। अवायवीय जीवाणुओं की खेती की यह विधि एक विशेष वैक्यूम उपकरण - एक माइक्रोएनेरोस्टेट में उनकी खेती के लिए कम हो जाती है। इसमें हवा को 10% हाइड्रोजन और 5% कार्बन डाइऑक्साइड के साथ नाइट्रोजन के एक विशेष गैस मिश्रण से बदल दिया जाता है।
2. रासायनिक। इनमें शामिल हैं: अवशोषक एजेंटों का उपयोग (जैसे Fe, Na₂S₂O₄, CuCl) या कम करने वाले एजेंट (जैसे एस्कॉर्बिक एसिड)।
3. जैविक। यह बंद प्रणाली में एरोबेस और एनारोबेस की सह-खेती के लिए नीचे आता है। बैक्टीरिया पैदा करने की इस पद्धति में पेट्री डिश के आधे हिस्से को बैक्टीरिया की कुछ एरोबिक प्रजातियों के साथ, और दूसरे आधे को अध्ययन किए गए एनारोब के साथ बोना शामिल है। इसका विकास उस समय शुरू होगा जब सारी ऑक्सीजन खत्म हो जाएगी।

अवायवीय जीवाणुओं की खेती के लिए निम्नलिखित विधियाँ उपयुक्त हैं:

• सतह परत में;
• स्टेराइल पैराफिन से भरी सतह परत में;
• घने पोषक माध्यम की मोटाई में;
• चिपचिपा मीडिया की गहरी परतों में।

शुद्ध संस्कृति की प्राप्ति

सूक्ष्म जीवविज्ञानी आमतौर पर कई अलग-अलग प्रकार के रोगाणुओं के नमूनों के साथ काम करते हैं। हालांकि, सूक्ष्मजीवों (परिवार, जीनस, प्रजातियों) की व्यवस्थित स्थिति निर्धारित करने के साथ-साथ उनकी विशेषताओं का अध्ययन करने के लिए, उन्हें अलग करना और शुद्ध संस्कृति विकसित करना आवश्यक है। कई खाद्य उद्योगों में उनका बहुत महत्व है, उदाहरण के लिए, पनीर, ब्रेड, क्वास, वाइन, आदि। लैक्टिक एसिड बैक्टीरिया की खेती से प्राप्त करना संभव हो जाता हैकिण्वित दूध उत्पादों, आटा, कोको, साइलेज और यहां तक कि प्लास्टिक के उत्पादन के लिए एक आवश्यक घटक।

एक शुद्ध संस्कृति को घने माध्यम में अलग करने की विधि सूक्ष्मजीव कोशिकाओं के यांत्रिक पृथक्करण के साथ उनकी बाद की पृथक खेती पर आधारित है। नमूना पानी या खारा (मात्रा 10-100 मिलीलीटर) की एक बाँझ मात्रा में स्थानांतरित किया जाता है और फिर दो मिनट के लिए हिलाया जाता है। अध्ययन के तहत सामग्री (उदाहरण के लिए, सॉसेज या पनीर) की मोटाई में स्थित सूक्ष्मजीवों को निकालने के लिए, पहले नमूना के टुकड़ों को रेत के साथ बाँझ उपकरणों से रगड़ कर किया जाता है। वह सामग्री जिसकी प्रारंभिक तैयारी हुई है, जिसका वजन 1 ग्राम या 1 मिली की मात्रा है, बाँझ पानी से 10, 100, 1000, आदि बार पतला होता है। कमजोर पड़ने की डिग्री को चुना जाता है जो विधि की क्षमताओं के अनुरूप कोशिकाओं की एकाग्रता देता है।

सूक्ष्मजीवों की बाद की खेती एक पोषक माध्यम तैयार करना है। आमतौर पर एक सघन माध्यम (MPA) चुना जाता है। इसे पहले पिघलाया जाता है और 45-50 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा किया जाता है, और उसके बाद ही इसे कई पेट्री डिश (तीन से पांच टुकड़े) में डाला जाता है, जिसके तल पर विभिन्न सांद्रता के परीक्षण पदार्थ से स्वैब रखे जाते हैं। इसके बाद, अभी भी जमे हुए पोषक माध्यम और उसमें डाली गई सामग्री का मिश्रण नहीं किया जाता है। सब्सट्रेट के आयतन में विभिन्न बिंदुओं पर कोशिकाओं को इस प्रकार स्थिर किया जाता है।

अगला, पेट्री डिश को थर्मोस्टैट में 22 डिग्री सेल्सियस पर 2 दिनों के लिए रखा जाता है। इस समय के दौरान, कोशिकाएं इस हद तक गुणा करती हैं कि प्रत्येक कोशिका द्वारा बनाई गई कॉलोनी नग्न आंखों को दिखाई देने लगती है। उनमें से प्रत्येक बैक्टीरिया के प्रकार की एक शुद्ध संस्कृति है जिसकी कोशिकाओं से यहगुलाब.

उसके बाद, पेट्री डिश से, सूक्ष्मजीवों को पोषक माध्यम से भरे अलग टेस्ट ट्यूब में उपसंस्कृत किया जाता है। इस तरह, शुद्ध संस्कृतियों को मिश्रित नमूने से अलग किया जाता है। इस पद्धति को इसके विकासकर्ता - आर. कोच का नाम दिया गया है। इसे आमतौर पर कप विधि या घटती बुवाई भी कहा जाता है। विभिन्न प्रकार के जीवाणुओं की शुद्ध कल्चर प्राप्त करने के बाद, उनके आकार, बीजाणुओं और परिवारों का निर्धारण किया जाता है।

सभी कार्य अपूतिता के सिद्धांतों के अनुसार ही करने चाहिए। सूक्ष्मजीवों के समय से पहले विकास से बचने के लिए, नमूना लेने के तुरंत बाद अध्ययन किया जाना चाहिए। पहले भाग को निकालने के बाद नल के पानी का विश्लेषण किया जाता है, क्योंकि उनमें पाइप और नल में जमा हुए रोगाणु हो सकते हैं। फलों, जामुनों और सब्जियों का माइक्रोफ्लोरा मुख्य रूप से सतह (छील) पर स्थित होता है, इसलिए इससे धुलाई की जाती है। ऐसा करने के लिए, भ्रूण को एक बाँझ कंटेनर में रखें और इसे आवश्यक मात्रा में पानी से भरें। फिर उन्हें काफी जोर से हिलाया जाता है और पानी दूसरे कंटेनर में डाला जाता है। कपड़ा उत्पादों से फसलें भी स्वाब में प्राप्त की जाती हैं, लेकिन पहले उनमें से एक निश्चित आकार के टुकड़े काट दिए जाते हैं।