सूक्ष्म जीव विज्ञान में चने के दाग का व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है क्योंकि यह बैक्टीरिया को उनकी कोशिका भित्ति की संरचना के आधार पर अंतर करने के सबसे आसान तरीकों में से एक है। ग्राम के अनुसार, सभी जीवाणुओं को ग्राम-पॉजिटिव (ग्राम (+)) और ग्राम-नेगेटिव (ग्राम (-)) में विभाजित किया जा सकता है। ग्राम स्टेन विधि 1884 में विकसित की गई थी और तब से इसकी लोकप्रियता कम नहीं हुई है, हालांकि इसे कई बार संशोधित किया गया है।
कोशिका दीवार की संरचना
ग्राम धुंधला होने से पता चलता है कि कोई जीवाणु ग्राम-पॉजिटिव है या ग्राम-नेगेटिव। बैक्टीरिया का ग्राम (+) और ग्राम (-) में विभाजन उनकी कोशिका भित्ति की संरचना के अनुसार किया जाता है।
कोशिका की दीवार में पेप्टिडोग्लाइकन (म्यूरिन) की सबसे बड़ी मात्रा होती है - एक जटिल पदार्थ, जिसमें पेप्टापेप्टाइड और ग्लाइकेन शामिल हैं। ग्लाइकेन में एन-एसिटाइलग्लुकोसामाइन और एन-एसिटाइलमुरैमिक एसिड के वैकल्पिक अवशेष होते हैं जो β-1 द्वारा एक दूसरे से जुड़े होते हैं,4-ग्लाइकोसिडिक बांड। पेप्टिडोग्लाइकन कोशिका के आकार का रखरखाव, आसमाटिक सुरक्षा और एंटीजेनिक कार्य प्रदान करता है।
ग्राम-पॉजिटिव और ग्राम-नेगेटिव बैक्टीरिया के बीच मुख्य अंतर
विभिन्न जीवाणुओं में अलग-अलग पेप्टिडोग्लाइकन परत की मोटाई होती है। ग्राम-पॉजिटिव के रूप में वर्गीकृत बैक्टीरिया में, यह 15 से 80 एनएम तक होता है, जबकि ग्राम-नेगेटिव में यह 2 से 8 एनएम तक होता है। इसी समय, ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया में पेप्टिडोग्लाइकन परत के नीचे एक विशेष संरचना होती है, जो ग्राम-पॉजिटिव बैक्टीरिया में नहीं होती है - पेरिप्लास्मिक स्थान। यह स्थान हाइड्रोलाइटिक एंजाइमों से भरा होता है - β-lactamase, ribonuclease 1, phosphatase। यह ये एंजाइम हैं जो कई एंटीबायोटिक दवाओं के लिए ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया के प्रतिरोध के लिए जिम्मेदार हैं।
बैक्टीरिया की ग्राम (-) पेप्टिडोग्लाइकन परत लिपोपॉलीसेकेराइड से बंधी होती है, एक एंटीजेनिक संरचना जिसमें एंडोटॉक्सिन होता है। ग्राम (+) बैक्टीरिया में, टेकोइक एसिड समान कार्य करते हैं।
ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया की एक अतिरिक्त संरचना होती है - बाहरी झिल्ली।
धुंधला करने की विधि का सार
इससे पहले कि आप धुंधला होना शुरू करें, अध्ययन किए गए बैक्टीरिया के स्मीयर तैयार किए जाते हैं। ऐसा करने के लिए, पानी को एक कांच की स्लाइड पर टपकाया जाता है और एक जीवाणु लूप के साथ सूक्ष्मजीवों की संस्कृति को वहां जोड़ा जाता है। फिर, पानी के पूरी तरह से सूख जाने के बाद, स्मीयर को ठीक कर दिया जाता है - कांच की स्लाइड को कई बार बर्नर की लौ पर ले जाया जाता है। जीवित जीवाणुओं के धुंधला होने की तुलना में ग्राम धुंधला अधिक प्रभावी होता है - डाई अणु मृत कोशिकाओं को बेहतर ढंग से बांधते हैं।
रंग कई चरणों में किया जाता है:
- फिल्टर पेपर के छोटे टुकड़ों को एक निश्चित स्मीयर पर रखा जाता है और मुख्य डाई डाली जाती है - जेंटियन वायलेट या मेथिलीन ब्लू।
- 3-5 मिनट के बाद, रंगीन फिल्टर पेपर को हटा दें और 1 मिनट के लिए स्मीयर को लुगोल के घोल से भरें। इस मामले में, तैयारी गहरा जाती है।
- लुगोल का घोल निकाल दिया जाता है और स्मीयर को शुद्ध एथिल अल्कोहल से उपचारित किया जाता है: तैयारी पर कुछ बूंदों को टपकाया जाता है, 20 सेकंड के बाद सूखा जाता है। प्रक्रिया 2-3 बार दोहराई जाती है।
- टेस्ट स्लाइड को डिस्टिल्ड वॉटर से धो लें।
- अतिरिक्त धुंधलापन पैदा करें - फुकसिन के साथ तैयारी समाप्त करें। 1-2 मिनट के बाद, डाई धो दी जाती है।
- पानी सूख जाने के बाद, एक माइक्रोस्कोप के तहत स्मीयर की जांच करें। ग्राम-पॉजिटिव बैक्टीरिया नीले-बैंगनी होंगे, ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया गुलाबी या लाल होंगे।
विभिन्न धुंधला पैटर्न के कारण
जैसा कि ऊपर बताया गया है, ग्राम-पॉजिटिव बैक्टीरिया नीले-बैंगनी रंग के होते हैं, जबकि ग्राम-नेगेटिव बैक्टीरिया लाल या गुलाबी रंग के होते हैं। इस विधि द्वारा जीवाणुओं के विभेदक धुंधलापन का कारण यह है कि जेंटियन वायलेट के घुलनशील रूप के कोशिका में प्रवेश करने के बाद, डाई अघुलनशील आयोडीन रूप में चली जाती है। एथिल अल्कोहल के साथ बैक्टीरिया के उपचार के दौरान, इस गैर-ध्रुवीय विलायक की कार्रवाई के तहत झिल्ली से लिपिड निकाले जाते हैं। झिल्ली तब झरझरा हो जाती है और अब लीचिंग को डाई करने के लिए एक महत्वपूर्ण बाधा नहीं है। हालांकिपेप्टिडोग्लाइकन अल्कोहल सहित गैर-ध्रुवीय सॉल्वैंट्स के लिए अधिक प्रतिरोधी है। यह वह है जो डाई को धोने से रोकता है, इसलिए म्यूरिन की मोटी परत वाले बैक्टीरिया नीले-बैंगनी (ग्राम-पॉजिटिव) हो जाते हैं, और शराब के साथ उपचार के बाद वे अपना रंग नहीं बदलते हैं।
ग्राम-नेगेटिव बैक्टीरिया की पतली म्यूरिन परत डाई अणुओं को सेल में नहीं रख पाती है, इसलिए अल्कोहल की क्रिया के बाद वे रंगहीन हो जाते हैं - ग्राम-नेगेटिव दाग।
फ्यूकसिन के संपर्क में आने के बाद, ग्राम-दाग वाले बैक्टीरिया नीले-बैंगनी रहते हैं, जबकि ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया गुलाबी-लाल हो जाते हैं।
ग्राम(+) और ग्राम(-) बैक्टीरिया के उदाहरण
ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया में सायनोबैक्टीरिया, सल्फर बैक्टीरिया, आयरन बैक्टीरिया, क्लैमाइडिया, रिकेट्सिया, एसिटिक बैक्टीरिया, कई मिथाइलोबैक्टीरिया, थियोनिक बैक्टीरिया, आर्सेनिटोबैक्टीरिया, कार्बोक्सीबैक्टीरिया शामिल हैं।
बिफीडोबैक्टीरिया, कई जलीय बैक्टीरिया, स्ट्रेप्टोकोकी और स्टेफिलोकोसी ग्राम-पॉजिटिव हैं।
