अकार्बनिक और कार्बनिक मीडिया द्वारा प्रकाश का अवशोषण और आगे पुन: उत्सर्जन फॉस्फोरेसेंस या फ्लोरोसेंस का परिणाम है। घटना के बीच का अंतर प्रकाश अवशोषण और धारा के उत्सर्जन के बीच अंतराल की लंबाई है। प्रतिदीप्ति के साथ, ये प्रक्रियाएं लगभग एक साथ होती हैं, और स्फुरदीप्ति के साथ, कुछ देरी के साथ।
ऐतिहासिक पृष्ठभूमि
1852 में, ब्रिटिश वैज्ञानिक स्टोक्स ने सबसे पहले प्रतिदीप्ति का वर्णन किया। उन्होंने फ़्लोरस्पार के साथ अपने प्रयोगों के परिणामस्वरूप नया शब्द गढ़ा, जो पराबैंगनी प्रकाश के संपर्क में आने पर लाल बत्ती का उत्सर्जन करता है। स्टोक्स ने एक दिलचस्प घटना का उल्लेख किया। उन्होंने पाया कि फ्लोरोसेंट प्रकाश की तरंग दैर्ध्य हमेशा उत्तेजना प्रकाश की तुलना में अधिक लंबी होती है।
कल्पना की पुष्टि के लिए 19वीं शताब्दी में कई प्रयोग किए गए। उन्होंने दिखाया कि पराबैंगनी प्रकाश के संपर्क में आने पर विभिन्न प्रकार के नमूने प्रतिदीप्त होते हैं। सामग्री शामिल है, दूसरों के बीच, क्रिस्टल, रेजिन, खनिज, क्लोरोफिल,औषधीय कच्चे माल, अकार्बनिक यौगिक, विटामिन, तेल। जैविक विश्लेषण के लिए रंगों का प्रत्यक्ष उपयोग 1930 में ही शुरू हुआ
प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी विवरण
20वीं शताब्दी के पूर्वार्द्ध में शोध में प्रयुक्त कुछ सामग्रियां अत्यधिक विशिष्ट थीं। संकेतकों के लिए धन्यवाद जो विपरीत तरीकों से हासिल नहीं किया जा सका, फ्लोरोसेंस माइक्रोस्कोपी विधि जैव चिकित्सा और जैविक अनुसंधान दोनों में एक महत्वपूर्ण उपकरण बन गई है। प्राप्त परिणामों का भौतिक विज्ञान के लिए कोई छोटा महत्व नहीं था।
फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के क्या लाभ हैं? नई सामग्रियों की मदद से अत्यधिक विशिष्ट कोशिकाओं और सबमाइक्रोस्कोपिक घटकों को अलग करना संभव हो गया। एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप आपको व्यक्तिगत अणुओं का पता लगाने की अनुमति देता है। विभिन्न प्रकार के रंग आपको एक ही समय में कई तत्वों की पहचान करने की अनुमति देते हैं। यद्यपि उपकरण का स्थानिक संकल्प विवर्तन सीमा द्वारा सीमित है, जो बदले में, नमूने के विशिष्ट गुणों पर निर्भर करता है, इस स्तर से नीचे के अणुओं का पता लगाना भी काफी संभव है। विभिन्न नमूने विकिरण के बाद ऑटोफ्लोरेसेंस प्रदर्शित करते हैं। इस घटना का व्यापक रूप से पेट्रोलॉजी, वनस्पति विज्ञान, अर्धचालक उद्योग में उपयोग किया जाता है।
विशेषताएं
पशु ऊतकों या रोगजनक सूक्ष्मजीवों का अध्ययन अक्सर बहुत कमजोर या बहुत मजबूत गैर-विशिष्ट ऑटोफ्लोरेसेंस द्वारा जटिल होता है। हालांकि, में मूल्यअनुसंधान एक विशिष्ट तरंग दैर्ध्य पर उत्तेजित घटकों की सामग्री में परिचय प्राप्त करता है और आवश्यक तीव्रता का एक प्रकाश प्रवाह उत्सर्जित करता है। फ्लोरोक्रोम संरचनाओं (अदृश्य या दृश्यमान) से आत्म-संलग्न करने में सक्षम रंगों के रूप में कार्य करते हैं। साथ ही, वे लक्ष्य और क्वांटम उपज के संबंध में उच्च चयनात्मकता से प्रतिष्ठित हैं।
प्राकृतिक और सिंथेटिक रंगों के आगमन के साथ प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का व्यापक रूप से उपयोग किया जाने लगा है। उनके पास विशिष्ट उत्सर्जन और उत्तेजना तीव्रता प्रोफाइल थे और विशिष्ट जैविक लक्ष्यों के उद्देश्य से थे।
व्यक्तिगत अणुओं की पहचान
अक्सर, आदर्श परिस्थितियों में, आप एक ही तत्व की चमक दर्ज कर सकते हैं। ऐसा करने के लिए, अन्य बातों के अलावा, पर्याप्त रूप से कम डिटेक्टर शोर और ऑप्टिकल पृष्ठभूमि सुनिश्चित करना आवश्यक है। फोटोब्लीचिंग के कारण विनाश से पहले एक फ्लोरेसिन अणु 300,000 फोटॉन तक का उत्सर्जन कर सकता है। 20% संग्रह दर और प्रक्रिया दक्षता के साथ, उन्हें लगभग 60 हजार की राशि में पंजीकृत किया जा सकता है
प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी, हिमस्खलन फोटोडायोड्स या इलेक्ट्रॉन गुणन पर आधारित, शोधकर्ताओं को सेकंड के लिए और कुछ मामलों में मिनटों के लिए व्यक्तिगत अणुओं के व्यवहार का निरीक्षण करने की अनुमति देता है।
कठिनाइयां
मुख्य समस्या ऑप्टिकल पृष्ठभूमि से शोर दमन है। इस तथ्य के कारण कि फिल्टर और लेंस के निर्माण में उपयोग की जाने वाली कई सामग्रियां कुछ ऑटोफ्लोरेसेंस प्रदर्शित करती हैं, प्रारंभिक चरणों में वैज्ञानिकों के प्रयासों को जारी करने पर ध्यान केंद्रित किया गया था।कम प्रतिदीप्ति वाले घटक। हालांकि, बाद के प्रयोगों ने नए निष्कर्ष निकाले। विशेष रूप से, कम पृष्ठभूमि और उच्च उत्तेजना प्रकाश उत्पादन प्राप्त करने के लिए कुल आंतरिक प्रतिबिंब पर आधारित फ्लोरोसेंस माइक्रोस्कोपी पाया गया है।
तंत्र
कुल आंतरिक परावर्तन पर आधारित प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के सिद्धांत तेजी से क्षय होने वाली या गैर-प्रसार तरंग का उपयोग करना है। यह विभिन्न अपवर्तक सूचकांकों वाले मीडिया के बीच इंटरफेस में उत्पन्न होता है। इस मामले में, प्रकाश किरण एक प्रिज्म से होकर गुजरती है। इसका अपवर्तनांक उच्च होता है।
प्रिज्म एक जलीय घोल या कम पैरामीटर वाले ग्लास से सटा होता है। यदि प्रकाश की किरण को उस कोण पर निर्देशित किया जाता है जो महत्वपूर्ण कोण से अधिक होता है, तो बीम पूरी तरह से इंटरफ़ेस से परिलक्षित होता है। यह घटना, बदले में, एक गैर-प्रसार लहर को जन्म देती है। दूसरे शब्दों में, एक विद्युत चुम्बकीय क्षेत्र उत्पन्न होता है जो 200 नैनोमीटर से कम की दूरी पर कम अपवर्तनांक वाले माध्यम में प्रवेश करता है।
एक गैर-प्रसार तरंग में, प्रकाश की तीव्रता फ्लोरोफोर्स को उत्तेजित करने के लिए पर्याप्त होगी। हालांकि, इसकी असाधारण उथली गहराई के कारण, इसकी मात्रा बहुत कम होगी। परिणाम एक निम्न-स्तरीय पृष्ठभूमि है।
संशोधन
कुल आंतरिक परावर्तन पर आधारित प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी को एपि-रोशनी के साथ महसूस किया जा सकता है।इसके लिए बढ़े हुए संख्यात्मक एपर्चर वाले लेंस की आवश्यकता होती है (कम से कम 1.4, लेकिन यह वांछनीय है कि यह 1.45-1.6 तक पहुंच जाए), साथ ही साथ तंत्र के आंशिक रूप से प्रकाशित क्षेत्र। उत्तरार्द्ध एक छोटे से स्थान के साथ हासिल किया जाता है। अधिक एकरूपता के लिए, एक पतली अंगूठी का उपयोग किया जाता है, जिसके माध्यम से प्रवाह का हिस्सा अवरुद्ध हो जाता है। एक महत्वपूर्ण कोण प्राप्त करने के लिए जिसके बाद पूर्ण प्रतिबिंब होता है, लेंस में विसर्जन माध्यम के उच्च स्तर के अपवर्तन और माइक्रोस्कोप कवर ग्लास की आवश्यकता होती है।
